Авторы: П.А. МЫНКИН, ООО «Ангелия Сайентифик», С.И. СВИРИДЕНКО, ООО «ЗИБИО МЕДИКАЛ РУС».
Современные лаборатории предприятий, выбирая модель своего развития на относительно длительный период, все чаще ориентируются на мировой опыт и успешные решения лидеров отрасли.
Перед современной промышленностью и наукой ставятся задачи, где все более актуальными становятся методы быстрого и надежного анализа как индивидуальных веществ, так и сложных смесей на молекулярном уровне.
Для большинства лабораторий остаются привлекательными классические методы анализа (например, УФ- и ИК-спектроскопия), которые в основном не предполагают применения дорогостоящего оборудования, но требуют достаточно большого объема образцов в чистом состоянии и длительной пробоподготовки. К сожалению, данные методы не решают всего комплекса задач, поскольку имеют недостаточную чувствительность, селективность, требуют обширных баз данных и дают представления в основном о характеристиках вещества (тип ароматической системы или сопряженного хромофора, наличие функциональных групп и др.). Поэтому, в дополнение к таким методам, в лабораториях широко применяются методы жидкостной (ВЭЖХ) и газовой хроматографии (ГХ) с различным набором детекторов, использование которых обеспечивает соответствие требованиям отраслей по селективности и чувствительности. С их помощью определяется большое число параметров, характеризующих идентификацию и количественную оценку содержания компонентов.
Несмотря на небольшое количество слабых сторон ВЭЖХ и ГХ, конкуренцию им все больше и чаще составляют масс-спектрометрические методы (МС). Ранее эти методы решали в основном научные задачи, но сегодня с их помощью решается все большее количество аналитических задач, например установление структуры неизвестных органических соединений различного происхождения, в том числе природных, синтетических, метаболитов лекарственных веществ. МС дает важную информацию для определения состава и структуры молекул. Таким образом, внимание специалистов производственных предприятий все чаще стали привлекать успешные решения и методы исследований, основным применением которых ранее были научные исследования и специальные области знаний. Оказалось, что многие из них уже активно применяются в мировой практике, дают хорошие результаты, как для единичных испытаний, так и для рутинных анализов. При этом особая ценность многих решений отмечается для лабораторий контроля качества, в том числе фармацевтических предприятий. В частности, времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, далее – МАЛДИ) уже активно используется в мире не только в клинической диагностике для классификации и идентификации микроорганизмов, но и для решения многих других аналитических задач в других отраслях. Последние публикации в этой области подтверждают эффективность и коммерческую целесообразность применения данного оборудования для решений в самых различных случаях.
Метод МАЛДИ относительно молодой (впервые описан в 1985–87 гг.) и перспективный. В 2002 г. ученый К. Танака, разработавший и развивший метод мягкой лазерной десорбции (soft laser desorption, SLD), был удостоен Нобелевской премии. Также научным сообществом были отмечены достижения ученых Ф. Хилленкампа и М. Караса, разработавших наиболее активно применяемый в настоящее время метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации.
В основе метода лежит процесс облучения короткими лазерными импульсами смеси компонентов, состоящей из матрицы и исследуемого вещества. В качестве матрицы используется вещество с меньшей молекулярной массой по сравнению с исследуемым веществом и обладающее высокой способностью к поглощению лазерного излучения. В точке удара лазера матрица выбрасывается в газовую фазу в виде частиц конденсированной материи, содержащей, в том числе, молекулы исследуемого вещества, параллельно передавая свой заряд исследуемому веществу (так называемая вторичная ионизация). Далее ионы ускоряются с помощью электрического поля и движутся в вакуумной трубе от источника ионизации (катода) к анодудетектору. Разделение ионов в потоке происходит за счет разницы во времени пролета: ионы меньшего размера быстрее прилетают на детектор и, соответственно, раньше регистрируются в виде пика.
Метод МАЛДИ становится все более мощным аналитическим инструментом в химических и биологических исследованиях за счет высокой производительности и чувствительности, мягкой и эффективной ионизации нелетучих веществ, толерантности к присутствию примесей, быстроте определения молекулярных масс, а также относительной простоте получаемых масс-спектров. Также он является методом, дополняющим информацию, получаемую с помощью других физико-химических методов анализа.
Основными преимуществами метода являются:
- Универсальность, поскольку он подходит для анализа соединений любой полярности и чувствительности к температуре, а также степени сложности;
- Высокая чувствительность, не достижимая никакими другими методами, позволяющая обойтись незначительным количеством образца для анализа;
- Возможность работать с неочищенными образцами, поскольку на одном спектре можно наблюдать наличие всех компонентов сложной смеси без предварительного сложного и длительного по времени разделения и очистки на индивидуальные компоненты, что экономит время и снижает затраты на пробоподготовку;
- Возможность идентификации за счет точного измерения массы с высоким разрешением является важным инструментом, наряду с другими спектральными методами для подтверждения структуры природных соединений.
Спектр идентификации E.coli (кишечная палочка) с коэффициентом соответствия 2.3
Метод МАЛДИ также позволяет определять как простые, так и очень сложные биологические молекулы (молекулярные ионы которых имеют массы от нескольких Дальтон до 500 000 Да), характеризуется низкой фрагментацией анализируемых соединений, а также высокой интенсивностью пиков молекулярных ионов; может анализировать наиболее термолабильные, труднолетучие, высокомолекулярные соединения, которые нельзя исследовать другими методами. Однако в микробиологии для идентификации нужен диапазон от 2000 до 20 000 Да. Размеры полипептидов из рибосомальных белков попадают в этот диапазон. При этом требуются особые навыки и знания от пользователей, поскольку во многих случаях довольно сложно выбрать матрицу, подобрать количественное соотношение матрица / исследуемое соединение и мощность лазерного излучения.
В настоящий момент с помощью данного метода успешно решаются задачи анализа индивидуальных веществ, белков из двумерного геля, протеолитических пептидов, синтетических полимеров, биополимеров, а также микробиологического анализа, масс-спектрометрической визуализации данных и других направлений.
Сравнение спектров Aureobasidium pullulans после 3 и 7 суток выращивания на твердой питательной среде.
Одно из первых применений метода МАЛДИ в фармацевтике – это решение задачи определения ряда антибиотиков, таких как гентамицин С1, стрептомицин, бензатина бензилпенициллин, линкомицин, тетрациклин, хлортетрациклин, эритромицин и других. Антибиотики и в настоящее время являются популярными объектами исследования. В отрасли контролируют различные группы антибиотиков, такие, например, как фторхинолоны, эритромицин и азитромицин.
Использование метода МАЛДИ также оказалось успешным для фармацевтических соединений, таких как синтетические аналоги празозина, гуперзина, антиретровирусных средств, противораковых цитостатических препаратов, трициклических антидепрессантов и многих других.
Отмечается возможность использования метода МАЛДИ для определения неизвестной примеси при производстве лекарственного препарата эптифибатида (синтетический циклический гептапептид, содержащий 6 аминокислот и ω-меркаптопропионильный остаток). Благодаря полученному соотношению m/z удалось определить структуру неизвестной примеси.
Успешное применение метода в анализе разнообразных веществ связано с его способностью регистрировать молекулярные и квазимолекулярные ионы термически неустойчивых молекул, используя матрицы, поглощающие ультрафиолетовое излучение.
Правильный выбор матрицы является важнейшим фактором, определяющим успех анализа методом МАЛДИ. Основные требования к материалу матрицы заключаются в ее высокой способности поглощать лазерное излучение, кристаллизоваться с включением в структуру анализируемого вещества, переносить протоны в ходе процесса ионизации, инертности по отношению к анализируемому веществу, хорошей растворимости в растворителях, используемых для пробоподготовки, низкой летучести в условиях вакуума.
В ряде недавних научных статей описывается, что метод МАЛДИ, наряду с секвенированием, нашел широкое и успешное применение в пищевой индустрии, в частности для идентификации микроорганизмов, например, при анализе молока, сыворотки, сметаны. Этот процесс достаточно хорошо применяется во многих промышленных компаниях и сводится к выбору колонии, нанесению образца и матрицы на мишень. В результате лаборатории в короткий срок получают спектр и идентифицируют микроорганизмы, опираясь на обширную спектральную библиотеку.
Отмечалось, что методы МАЛДИ также успешно применялись в ветеринарии, например для исследования микроорганизмов, выделенных из желудка крупного рогатого скота. В экологии метод находил применение для идентификации извлеченных из почвы и воды культур, для анализа культур в сырой нефти. Успешно идентифицировались культуры до рода и вида.
Так как большинство таких матриц имеют молекулярную массу ниже 500 Да, ионы матрицы могут стать помехой в определении низкомолекулярных аналитов. Если матрица обеспечивает эффективность ионизации, минимальную или контролируемую фрагментацию и ионы матрицы незначительно интерферируют с ионами определяемого вещества, то ее можно использовать для анализа. Тем не менее, важными остаются такие преимущества метода, как широкий диапазон масс анализируемых соединений, возможность анализа высокомолекулярных соединений без разрушения молекулы, высокая чувствительность от 10-12 до 10-21 моль исследуемого вещества, хорошая толерантность к солям, возможность работы с многокомпонентными смесями и довольно простая интерпретация масс-спектров.
На рынке Российской Федерации возникла непростая ситуация в связи с уходом из РФ производителей – лидеров мирового приборостроения, в том числе и производителей приборов, базирующихся на данном методе. Однако за последние несколько лет в России была проделана большая работа по выводу на рынок альтернативных приборов.
Одним из таких приборов является масс-спектрометрическая система EXS 2000, представленная на рынке компанией Angelia Scientific. Прибор может быть успешно применен для обнаружения микроорганизмов и контроля качества фармацевтических препаратов, идентификации микроорганизмов на производствах пищевых продуктов и при контроле пищевой безопасности, микробиологических испытаний и тестирования в области научных исследований, промышленности, для сельского хозяйства, охраны окружающей среды, животноводства и ветеринарии. Кроме того, можно отметить, что прибор нашел применение в области инспекции и карантина, в клинических стационарах, при профилактике и контроле внутрибольничных инфекций, для идентификации микроорганизмов и мониторинга в системе CDC.
Данный прибор имеет в своем составе азотный лазер с широким энергетическим профилем, линейный времяпролетный масс-анализатор (TOF), относительно компактные размеры 0,5 м × 0,8 м × 1,2 м и небольшую массу (116 кг), работает с операционной системой Windows 11, питается от стандартной электрической сети 220 В / 50 Гц при мощности до 1,8 кВт. Вакуумная система работает с турбомолекулярным насосом, рабочим вакуумом до 10-8 мБар. В комплекте поставляются необходимые расходные материалы, наборы реагентов, мишени и держатели. Для подготовки проб в лаборатории достаточно иметь простой набор оборудования (центрифуга под пробирки 1,5 мл, микродозаторы 100–1000 мкл и реагенты). Таким образом, система получается недорогой в эксплуатации и обслуживании, может обеспечить хороший поток анализов. В ряде случаев интерес представляет аналогичный прибор EXS 3000 с твердотельным лазером, ресурс которого достигает 11 млрд выстрелов.
Незначительное потребление расходных материалов и реагентов при наличии многоразовых пластин делает технологию масс-спектрометрии МАЛДИ не только экономически обоснованной, но и экологичной, особенно в сравнении с традиционными методами идентификации.
Таким образом, времяпролетная масс-спектрометрия МАЛДИ представляет собой уникальный высокоэффективный, точный и вместе с тем низкозатратный метод, получивший в последние годы широкое распространение. Простота использования позволяет применять методику в рутинных исследованиях. Появление новых приложений, позволяющих усовершенствовать диагностику инфекций и определить резистентность возбудителей к антибиотикам, делает эту методику привлекательной также для многопрофильных стационаров. Кроме того, интересным применением МАЛДИ могут стать возможности для молекулярного анализа и визуализации.
Постоянное совершенствование и оптимизация аппаратного и программного обеспечения приборов делают EXS 2000 одним из наиболее востребованных и перспективных систем молекулярного анализа сегодня, а возможность квалификации IQ/OQ оборудования и программного обеспечения в соответствии с требованиями CFR 21 Part 11 позволяет успешно применять эту систему для целей фармацевтической отрасли.
***
ООО «ПрофТрейдЛаб»
г.Москва
Телефон: +7(910)400-72-37
Электронная почта: sales@proftradelab.ru
Сайт: www.proftradelab.ru
