В домашней аптечке каждого человека можно найти самые различные лекарства, которые мы приобретаем как по предписанию врача, так и по собственной инициативе. Многие из нас слышали термин «антибиотикорезистентность», а вот о влиянии лекарственных препаратов на метаболизм друг друга мало кто задумывается. Ученые РНИМУ поставили перед собой амбициозную задачу изучить активность одних из самых важнейших и распространенных ферментов — цитохромов Р450. Именно от работы этих ферментов зависит как долго лекарство будет находиться в организме и как долго будет оказывать свое основное или побочное действие.
Об исследовании «Электрохимический анализ продуктов цитохром P450-зависимого метаболизма лекарственных препаратов» мы поговорили с заведующим Научно-исследовательской лаборатории биокаталитических систем Алексеем Владимировичем Кузиковым, кандидатом биологических наук, доцентом кафедры биохимии медико-биологического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Проект поддержан Российским научным фондом.
Фармакологическая мишень
Направлением нашей работы является разработка электрохимических систем для определения активности цитохромов P450. Цитохромы P450 – это важнейшие ферменты, катализирующие метаболизм лекарств. Эти ферменты также участвуют в метаболизме ряда эндогенных соединений, таких как стероидные гормоны, и являются важной фармакологической мишенью. Таким образом, цитохромы P450 имеют колоссальное медицинское значение. От их работы зависит как долго лекарство будет находиться в организме и как долго оказывать свое основное или побочное действие, как одно лекарство будет влиять на метаболизм других лекарств при проведении комплексной терапии, будет ли снижаться терапевтическое действие лекарства при метаболизме данными ферментами или наоборот – терапевтическое действие лекарства будет усиливаться. Чтобы ответить на эти вопросы, часто прибегают к моделированию метаболизма лекарства при участии цитохромов P450 in vitro. Активность цитохромов P450 по отношению к лекарственному соединению определяют путем анализа продуктов ферментативных реакций, однако данная задача не всегда просто решается с помощью стандартных аналитических методов. Например, часто приходится подбирать условия экстракции продуктов реакций, хроматографического и масс-спектрометрического анализов, а поскольку лекарственные соединения различаются по химической природе, то в каждом случае требуется подбирать оптимальные условия для анализа конкретного лекарства и его метаболита. Кроме того, чтобы цитохром P450 осуществлял свою функцию в пробирке, ему необходимы дополнительные белки, участвующие в переносе электронов от коферментов. Можно представить, какой объем работы необходимо выполнить и каких финансовых затрат требует определение активности цитохромов P450 при исследовании десятков или сотен лекарственных соединений. Очень многие проблемы позволяют решить электрохимические подходы для определения активности цитохромов P450. Мы имеем большой опыт в разработке электрохимических систем для исследования цитохромов P450 и постоянно совершенствуем их возможности для решения задач фармакологии. В рамках проекта мы предположили, что электрохимические системы для определения активности цитохромов P450 можно усовершенствовать, если количественно определять образующиеся продукты ферментативных реакций путем их электрохимического окисления. Это позволит избежать дополнительных времязатратных стадий анализа продуктов с помощью других стандартных для этих целей методов аналитической химии.
Мы полагаем, что перспективой развития таких систем может быть их использование в экспериментальной фармакологии при решении ряда задач, связанных с определением фармакокинетики лекарства и оценки вероятности возникновения побочных действий, связанных с ингибированием активности цитохромов P450.
Разработка электрохимических систем.
Основной целью нашей работы является разработка электрохимических систем для определения активности цитохромов P450.
В качестве конечного результата нашей работы мы бы хотели получить удобную в практическом использовании и универсальную аналитическую систему для решения задач фармакологии, связанных с определением активности цитохромов P450.
В рамках проекта нами исследованы электрохимические свойства ряда нестероидных противовоспалительных средств, противоэпилептических, противоопухолевых и антикоагулянтных препаратов. Полученные результаты позволили разработать электрохимические системы для определения трех фармакологически значимых изоферментов цитохрома P450, перспективных в дальнейших фармакологических исследованиях.
Разработанные аналитические системы могут использоваться в биомедицинских исследованиях при решении ряда задач, связанных с определением фармакокинетики лекарственного соединения и оценки вероятности возникновения побочных действий, связанных с ингибированием активности цитохромов P450.
Оригинальный подход для достижения практических результатов.
Исследования в этом направлении проводились, и есть достигнутые результаты. Например, разработаны коммерчески доступные тест-системы для определения активности фармакологически значимых изоформ цитохрома P450, основанные на анализе флуоресцентных метаболитов синтетических флуорогенных субстратов. Данные системы применяются в фармакологическом анализе, если требуется оценить влияние исследуемого соединения на активность той или иной изоформы цитохрома P450. Однако эти системы требуют использования как индивидуальных изоформ цитохрома P450, так и дополнительных белков, необходимых для его работы. Это значительно повышает стоимость таких исследований, по сравнению с нашим подходом. Кроме того, в рамках проекта мы используем регистрацию продуктов электрохимическими, а не флуорометрическими методами.
Принципиальное отличие состоит в том, что для работы нашей системы необходима только индивидуальная изоформа цитохрома P450, которая иммобилизуется на миниатюрном одноразовом электроде (диаметр рабочего электрода 2-4 мм). Электрод служит источником электронов для восстановления иона железа гема фермента, в результате чего фермент активируется и способен метаболизировать лекарственное соединение. Образующиеся продукты ферментативной реакции определяются на втором такого же размера электроде за счет их электрохимического окисления. Регистрируемый ток отражает концентрацию образующегося продукта. Предложенный нами подход для определения активности фармакологически значимых цитохромов P450 является полностью оригинальным и относительно простым в практическом применении.
Основное отличие нашей системы от классических систем для определения активности цитохромов P450 проиллюстрировано на рисунке 1.
На рисунке 2 представлены электроды, которые используются в нашей работе.
Влияние лекарственных соединений
Наша работа заключается в анализе электрохимических свойств лекарственных соединений и их метаболитов, образующихся в результате действия цитохромов P450. Если их электрохимические свойства различаются, мы можем одновременно регистрировать наличие и количество как самого лекарственного соединения, так и его метаболита в образце. Зная количество образующегося метаболита, можно рассчитать ферментативную активность цитохромов P450 и, например, сравнить её с той, которая наблюдается в присутствии какого-нибудь другого исследуемого соединения. Таким образом можно исследовать влияние различных лекарственных соединений на метаболизм друг друга и прогнозировать необходимость изменения дозировки при их совместном приеме. Кроме того, мы используем электрохимические методы и для активации работы ферментов суперсемейства цитохрома P450. Для этого мы подаём электроны с электрода на ион железа гема фермента, что позволяет ему активировать кислород и преобразовывать субстрат (например, лекарственное соединение). Такой подход позволяет избежать использования дополнительных белков и переносчиков электронов.
***